AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA BARREIRA ENDOTELIAL E SUA RELAÇÃO COM AS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS NA COVID-19

Objetivos: Os mecanismos fisiopatológicos que determinam a gravidade da Covid-19 estão associados a ativação da hemostasia e da imunidade inata, em um processo coletivamente referido como imunotrombose, e que envolve ativação plaquetária, geração de NETs (do inglês, Nucleo extracelular traps), expressão de fator tecidual, ativação do complemento e ativação endotelial. Um elemento importante da ativação endotelial é a quebra da barreira endotelial (BE), que ocorre para facilitar o acesso de leucócitos aos tecidos, onde contribuem para erradicação dos patógenos. No entanto, a avaliação da integridade da BE é desafiadora, exigindo o uso de modelos celulares. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do soro de pacientes com Covid-19 sobre a integridade da BE em monocamadas de células endoteliais, e sua correlação com características clínicas da doença. Materiais e métodos: A população do estudo consistiu em 30 pacientes com Covid-19 que apresentavam comprometimento pulmonar confirmado por tomografia de tórax, e necessidade de internação hospitalar por hipoxemia e 30 controles saudáveis pareados por sexo e idade. Os pacientes recrutados fizeram parte de um estudo clínico (REBEC: U1111-1250-1843), e as amostras utilizadas nesta avaliação foram obtidas no momento da internação, antes de qualquer intervenção. Monocamadas de células endoteliais de duas fontes (HUVECs: células de cordão umbilical;HULECs: células endoteliais pulmonares) foram estimuladas com soro de pacientes e indivíduos saudáveis (diluição 15% em meio de cultura) e a integridade da BE foi avaliada por um sensor de impedância celular (ECIS;Eletric Cell-substrate Impedance Sensing System) continuamente por 36 horas. Biomarcadores de gravidade e relacionados à ativação da hemostasia foram avaliados por kits comerciais. Dados clínicos foram obtidos a partir dos prontuários digitais. Resultados: O soro de pacientes com Covid-19 induziu quebra de BE significativamente mais acentuada que o de indivíduos saudáveis em HUVECs nos tempos 15 min (p < 0,01);30 min (p ≤ 0,001);1h (p ≤ 0,0001);2h (p ≤ 0,0001);3h (p ≤ 0,0001);4h (p ≤ 0,01) e 5h (p ≤ 0,05). Estes resultados foram confirmados no modelo de células endoteliais pulmonares (HULECs). A magnitude da quebra apresentou correlação significativa com desfechos clínicos relevantes como tempo de internação total (RS até 0.57) e tempo de UTI (RS = 0,47). Em relação a biomarcadores de interesse na Covid-19, a quebra da BE apresentou correlação significativa com neutrofilia, relação neutrófilo/linfócito, fator de Von Willebrand, fatores IX e XI, fibrinogênio, D-dímero e uPAR (Receptor de Uroquinase). Discussão: Através de um método considerado padrão-ouro para avaliação in vitro da integridade da BE nós demonstramos que componentes presentes no soro de pacientes com Covid-19 são capazes de promover a quebra da BE, e que a magnitude deste processo está relacionada à gravidade desta doença. A correlação com outros marcadores inflamatórios corrobora a conexão entre os mecanismos envolvidos na imunotrombose em pacientes com Covid-19. Conclusão: nossos resultados apontam a quebra da BE como um alvo terapêutico atrativo nestes pacientes.

Association of the angiopoietin/TIE2 and VEGF-a pathways with clinical and laboratory markers of disease severity incovid-19

Background : Endothelial barrier (EB) disruption is an important part of immunothrombosis, allowing the access of leukocytes to inflamed tissues. Pathways involving angiopoietin (Ang) 1 and 2 and their receptor Tie2, and VEGF-A/VE-cadherin (VEC) are key regulators of EB integrity. While the association of these mediators with sepsis severity have been known for more than 15 years, it was only recently that their role in coagulation activation was described. Moreover, these proteins also mediate angiogenesis, which has been shown to be upregulated in COVID-19. Aims : To measure circulating levels of key mediators of Ang/Tie2 and VEGF-A pathways in COVID-19 patients, and to explore their association with disease severity and hemostatic activation. Methods : Samples were obtained from patients admitted to a COVID-19 ward, within 24 h from COVID-19 confirmation. EB mediator levels were measured by immunological methods (Elisa or multiplex assays). The study was approved by the IRB and all participants provided written informed consent. Results : Data were obtained from 30 patients and 30 age and sexmatched healthy individuals. Mean length of hospital stay (LOS) was 12.9 ± 9.8 days respectively, twelve patients (40%) required intensive care (ICU), and 28/30 patients survived. Mean D-dimer was 3,609 ± 14,440 ng/mL. Levels of EB mediators are shown in Table 1. Associations between these parameters with relevant clinical and laboratory markers of disease severity are shown in Table 2. Conclusions : All mediators of EB disruption were significantly elevated in COVID-19 patients. In addition, these mediators were consistently associated with proteins involved in immunothrombosis, in particular with fibrinogen, VWF:Ag, uPAR, PAI-1 and P-selectin. Clinically significant associations were observed between Ang-2 and VEGF-A and extension of lung disease (for both) and ICU stay (for VEGF-A). Additional studies are warranted to explore the crosstalk between Ang/Tie2 and VEGF-A pathways with hemostasis in COVID-19.